技術リソース

組換えカスケード試薬（rCR）は、エンドトキシンアッセイ用に設計された組換えタンパク質ベースの検出システムであり、従来のLAL試薬に取って代わるものです。rCRは、リムルス凝固カスケード由来の主要な組換えタンパク質（組換え因子C、組換え因子B、および組換えプロクロージング酵素）で構成されています。これらのタンパク質は、天然LALのエンドトキシン認識およびシグナル増幅機能を再現するために、遺伝子工学によって発現されます。

BETMAT rCRの主な特徴は以下のとおりです。

➢ 高い特異性: rCR試薬には因子Gが含まれていないため、(1-->3)β-D-グルカンによる偽陽性のリスクを排除するエンドトキシン特異的試薬です。

➢ 安定性と一貫性：遺伝子組換え技術により、BETMATは天然LALのバッチ間のばらつきを回避するrCR試薬を製造することができます。

➢ 倫理的かつ持続可能：カブトガニの血液を使用する必要がなくなり、環境への影響を軽減します。

➢ 高感度：rCR試薬は因子C経路におけるシグナル増幅カスケードを模倣し、高感度で動態発色法を用いてエンドトキシンを検出することを可能にします。

BETMAT rCRは、天然LALキネティック発色アッセイと同様のキネティック発色アッセイです。このアッセイ方法は、既存のインキュベーション式マイクロプレートリーダー、ソフトウェア、およびキネティック発色アッセイ用のエンドトキシンフリーアクセサリと完全に互換性があります。BETMAT rCRアッセイ用に新たなエンドトキシンアッセイ機器について問い合わせる必要はありません。これにより、学習曲線が短縮され、コスト効率が向上するため、BETMAT rCRアッセイの導入が容易になります。

組換え因子C（rFC）と組換えカスケード試薬（rCR）はどちらもエンドトキシンアッセイに使用されますが、組成、反応原理、検出方法、性能特性において異なります。具体的な違いは以下のとおりです。

➢ 組成：rFCは、エンドトキシンによって活性化されるカブトガニセリンプロテアーゼ触媒カスケードのアメーバ細胞における最初の酵素である組換え因子Cという単一の酵素のみを含んでいます。一方、rCRは、組換え因子C、組換え因子B、および組換え凝固促進酵素の3つの酵素から構成されており、天然LAL試薬の組成と同様に、完全な反応カスケードを再構築しています。

➢ 反応原理：rFCを用いた検出では、エンドトキシンが組換え因子Cを活性化し、活性化された因子Cが蛍光基質を切断して蛍光シグナルを生成するという、比較的単純な一段階反応が行われます。rCRは、天然のLAL試薬の酵素結合反応を模倣しています。エンドトキシンが最初に組換え因子Cを活性化し、次に組換え因子Bを順次活性化し、最後に組換えプロ凝固酵素を凝固酵素に変換することで、3段階の反応連鎖を形成します。

➢ 検出方法：rFCは通常、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて終点アッセイにより蛍光シグナルを定量的に測定する必要があります。一方、rCRは動態吸光度マイクロプレートリーダーで検出でき、色の変化によってシグナルをモニタリングします。これは、従来の動態発色性LAL試薬の検出方法と同じです。

➢ 機器要件：rFC検出には蛍光ベースの機器が必要です。rCRは従来のLAL試薬と同じタイプの機器を使用でき、検出装置を変更する必要がないため、従来法を使用していた検査室にとっては移行がより容易です。

BETMAT社は、従来の発色性LALアッセイと同じ試験方法を用いてrCR試薬を開発しました。ユーザーは、従来の発色性LALアッセイと同様の方法でrCRアッセイを準備します。rCRアッセイでは、各ウェルに100 µlのサンプル、ネガティブコントロール、標準液、および100 µlのrCR試薬を使用します。

組換えカスケード試薬は世界的に認知度が高まっており、一部の薬局方では公式分析法として採用されている一方、他の薬局方では改良と標準化が進められている。具体的な規制状況は以下のとおりである。

➢ 米国：米国薬局方（USP）は、2025年5月に、組換え因子C（rFC）および組換えカスケード試薬（rCR）をUSP〈86〉組換え試薬を用いた細菌エンドトキシン試験に収載しました。規制によると、使用者は特定の製品への組換え試薬の適用性を確認する必要があります。

➢ ヨーロッパ：欧州薬局方（EP）は、一般章2.6.32「組換え因子Cを用いた細菌エンドトキシン試験」に組換え因子C法を収録しています。この方法では注射用水および精製水を直接検出できますが、複雑なマトリックスサンプルは検証後に使用する必要があります。ただし、現在EP 2.6.32には組換え因子C法のみが含まれており、組換えカスケード試薬はまだ収録されていません。

➢ 日本：日本薬局方では、組換えタンパク質試薬を記載しており、組換えタンパク質試薬を用いたエンドトキシン試験の手順と留意事項を記載したガイドライン＜G4-4-180＞細菌エンドトキシン試験及び組換えタンパク質試薬を用いた代替法をエンドトキシン試験の補助法としてrFC及びrCRを含めています。

はい、USP第〈86〉「組換え試薬を用いた細菌エンドトキシン試験」によれば、ユーザーはこの新しいアッセイを実施する前に、組換えカスケード試薬アッセイ法の妥当性を検証する必要があります。BETMATは、組換えカスケード試薬が特定の製品または材料の試験に適していることをユーザーが確認するための一次検証パッケージを提供します。

LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試験は、エンドトキシン（グラム陰性細菌（例：大腸菌、サルモネラ菌）の外膜に存在する毒性物質）の存在を検出するために広く用いられている生物学的検査法です。この検査は、カブトガニ（Limulus polyphemusまたは近縁種）の血液細胞（アメーバ細胞）に由来する特有の生物学的反応を利用しています。

その動作原理を簡単に説明します。

1. サンプル調製

試験サンプル（医薬品、医療機器、注射剤、環境水など）は、まず反応を阻害する可能性のある妨害物質（タンパク質、洗剤など）を除去する処理が施されます。次に、カブトガニのアメーバ細胞を溶解（破砕）して抽出したLAL試薬と混合されます。

2. エンドトキシン-LAL反応

エンドトキシンはLAL試薬中の特定のタンパク質に結合し、一連の酵素反応を引き起こします。この反応によってLAL中のプロ酵素が活性化され、活性酵素へと変換されます。

3．反応生成物の検出

活性酵素は、合成基質（混合物に添加される）の切断、または（従来のLAL試験における）凝固の形成を触媒する。

- ゲル凝固型LAL（最も広く用いられている形式）では、エンドトキシンが存在すると目に見えるゲルが形成される（酵素がLALタンパク質を架橋して固体ゲルにする）。

発色性LALでは、切断された基質から着色化合物が放出され、その色の強度を測定してエンドトキシン濃度と相関させる。

濁度測定法によるLALでは、反応によって混合液が濁り（濁度が増す）、その濁度を測定することでエンドトキシンを定量します。

4. 結果の解釈

陽性反応（ゲル形成、変色、または濁り）は、エンドトキシン汚染が規定の閾値を超えていることを示します。陰性反応は、サンプルにエンドトキシンが含まれていないこと（または安全基準値以下であること）を裏付けます。これは、医療製品において、患者の発熱、敗血症、または臓器障害を回避するために非常に重要です。

LAL（リムルスアメボサイトライセート）試薬は、グラム陰性細菌（大腸菌、サルモネラ菌など）の細胞壁から放出される有害物質であるエンドトキシンの存在を検出および定量するために広く使用されている生物学的アッセイです。

これは、アメーバ細胞溶解液（カブトガニ（Limulus polyphemus）の血液細胞から抽出された液体）の独特な性質を利用しています。エンドトキシンがこの溶解液と反応すると、凝固反応（ゲル形成）または色の変化が起こります。

一般的な用途としては、医薬品（注射剤、ワクチンなど）、医療機器（カテーテルなど）、注射用水などの検査が挙げられます。これらの製品に、ヒトに重篤な反応（発熱、敗血症など）を引き起こす可能性のあるエンドトキシンが含まれていないことを確認するためです。

LAL（リムルスアメボサイトライセート）アッセイは、エンドトキシン（グラム陰性菌の外膜の毒性成分）を検出・定量するための重要な方法です。エンドトキシンは、医薬品や医療環境中に存在すると、発熱、敗血症、臓器不全などの重篤な副作用を引き起こす可能性があります。このアッセイは主に以下のシナリオで実施され、それぞれについて簡単に説明します。

1. 医薬品およびバイオ医薬品の場合

ほとんどの注射剤、ワクチン、生物製剤（モノクローナル抗体など）、および非経口製剤（静脈内、筋肉内、または皮下投与される製品）に対して、この検査は義務付けられています。これらの製品におけるエンドトキシン汚染は患者に直接的なリスクをもたらすため、LAL検査は製造出荷前に規制上のエンドトキシン限度値（USP、EP、JP規格など）への適合性を確認します。

2. 医療機器の場合

血液、脳脊髄液（CSF）、または無菌組織に接触する医療機器（例：静脈カテーテル、血液透析フィルター、外科用インプラント、CSFシャント）には、この検査が義務付けられています。これらの機器は、製造工程や滅菌工程の不備によりエンドトキシンを保有している可能性があり、この検査によってエンドトキシンフリーであることが確認され、感染症や炎症反応の予防に役立ちます。

3. 原材料および製造環境向け

原材料：医薬品／医療機器に使用される成分（例：注射用水、賦形剤、細胞培養培地）について検査を行い、汚染された原材料を介してエンドトキシンが最終製品に混入するのを防ぎます。

環境モニタリング：クリーンルーム（例：医薬品製造施設）内の表面、空気、またはプロセス水に対して実施され、微生物制御を評価し、交差汚染を回避する。

4. 研究および特殊用途向け

生物学的研究においては、細胞培養試薬（血清、緩衝液など）中のエンドトキシン濃度を検証し、実験結果への干渉を回避する（エンドトキシンは細胞の挙動を変化させる可能性がある）。

獣医学においては、家畜やペットの安全性を確保するために、動物用ワクチンや注射剤の試験を行う。

組換えカスケード試薬（rCR）は、組換えリムルスアメボサイトライセート（rLAL）アッセイの主要構成要素であり、天然由来のLAL（カブトガニの血液細胞由来）は、いずれも細菌エンドトキシンの検出に広く用いられています。これは、医薬品、医療機器、生物製剤における重要な品質管理ステップです。これらの「優位性」は、コアとなる性能指標、実用性、持続可能性によって決まりますが、それぞれに明確な強みがありながらも、主要な分野では概ね同等です。

1. コア性能：エンドトキシン検出に関しては概ね同等
主要な機能である感度、特異度、精度に関して言えば、rCRはほとんどの日常的なエンドトキシン検査のニーズにおいて、天然由来のLALと同等の性能を発揮する。
● 感度：どちらも極めて低いレベルのエンドトキシンを検出でき（アッセイ形式にもよるが、通常は0.005～0.01 EU/mLまで）、世界的な規制要件（例：USP、EP、JP）を満たしています。
● 特異性：rCRは天然LALと同じエンドトキシン（リポ多糖、LPS）部分を標的とするため（リムルス凝固カスケードの最初のステップであるC因子活性化を介して）、LPSに対する偽陽性/偽陰性はほとんど発生せず、ほとんどのサンプルで天然LALの特異性に匹敵します。
● 正確性と精度：規制基準に従って検証された場合、rCRベースのアッセイ（例：rLALキネティック発色アッセイ）は天然LALと同様の再現性を示し、検査室やサンプルタイプ（例：注射薬、医療機器）間で一貫した結果が得られます。

2. rCRの天然LALに対する実用的な利点
天然LALは長年にわたり信頼性を証明してきたが、rCRは天然LAL源の主な限界を克服するものである。
● 持続可能性：天然のLALは、カブトガニ（一部地域では絶滅危惧種または準絶滅危惧種）の漁獲に依存しており、カブトガニを捕獲、採血、放流するという工程を経る（死亡率は約10～30%）。一方、rCRは微生物発酵（大腸菌や酵母など）によって生産されるため、野生のカブトガニの個体群への依存がなくなり、世界的な保全目標に合致する。
● 一貫性と供給安定性：天然LALは、カブトガニの年齢、生息地、または加工方法の違いにより、効力にばらつきが生じる可能性があります。rCRは高純度組換えタンパク質であるため、バッチ間のばらつきが最小限に抑えられ、より安定したアッセイ性能が保証されます。また、カブトガニの個体数減少や環境要因（気候変動、汚染など）による供給途絶も回避できます。
● 安全性および汚染リスク：天然のLALには、カブトガニの血液由来の微量汚染物質（他のタンパク質、阻害物質など）が含まれている可能性があり、特定のサンプル（複雑な生物製剤など）に干渉する可能性があります。組換えタンパク質であるrCRは、干渉リスクが低く、困難なサンプルの検証を簡素化します。

3. 天然LALが依然として好まれるニッチなシナリオ
ほとんどの標準的な用途では、rCRは天然LALと互換性がありますが、ごく特殊なケースでは天然LALの方がわずかに優位性があります。
● LPS以外の発熱物質の検出：天然LALは、まれにエンドトキシン以外の発熱物質（例えば、特定の細菌タンパク質）を間接的に検出することがありますが、これは主な機能ではありません。rCRは厳密にLPS特異的ですが、規制当局の試験はエンドトキシン（医薬品で最も一般的な発熱物質）に焦点を当てているため、これはほとんど問題になりません。
● 従来の検証：長年にわたり製造を続けているメーカーの中には、天然LALの検証データを数十年にわたって保有しており、rCRで再検証するよりも継続性を維持することを好む場合があります（ただし、FDAやUSPなどの規制機関は現在、rCRを代替手段として明示的に認めています）。
結論
実用的な用途のほとんどにおいて、rCRは天然由来のLALと同等の性能を発揮し、エンドトキシン検出における感度、特異性、精度において遜色ありません。さらに、rCRは持続可能性、供給の安定性、一貫性において重要な利点を提供し、ますます好ましい代替手段となっています。天然LALはニッチなシナリオや従来のワークフローにおいてのみ依然として有効ですが、rCRは現代のエンドトキシン検査において、同等（そして多くの場合、より優れている）のソリューションとして広く認識されています。

1. LAL試薬水とは何ですか？
LAL試薬水（LRW）は、リムルスアメボサイトライセート（LAL）試験専用に特別に処理された高純度水です。LAL試験は、細菌エンドトキシン（グラム陰性細菌、例えば大腸菌の外膜の毒性成分）を検出および定量するための標準的な方法です。

その主な役割は、LALテストのワークフロー全体を通して、希釈剤、ブランク、または試薬溶媒として機能することです。例えば、次のようになります。
● 試験サンプル（医薬品、医療機器、注射剤など）を、エンドトキシン検出に適した濃度に希釈する。
● LAL試薬の作業溶液を調製する（例：凍結乾燥LAL粉末を溶解する）。
● 外部エンドトキシンが混入していないことを確認することで、検査の精度を検証するための陰性対照（ブランク）として機能します。

LAL試験に干渉しないようにするため、LRWは一般的な精製水（例：USP精製水または注射用水）を超える厳格な純度基準を満たす必要があります。主な要件は以下のとおりです。
● エンドトキシンフリー：検出可能な細菌性エンドトキシンが存在しない（検査の妥当性にとって重要）。
● ミネラル含有量が低い：LAL-エンドトキシン反応を阻害する可能性のあるイオン（カルシウム、マグネシウムなど）が最小限です。
● 中性pH：通常は6.0～8.0。極端なpH値はLALタンパク質を変性させ、検査を妨げる可能性があります。
● 妨害物質がないこと：LAL凝固カスケードを活性化（偽陽性）または阻害（偽陰性）する可能性のある化合物（例：洗剤、キレート剤、または水処理からの残留化学物質）が存在しないこと。

2. LAL試薬用水はなぜエンドトキシンフリー基準を満たさなければならないのか？
LALテストは、LAL（カブトガニの血液細胞から抽出したタンパク質）と細菌エンドトキシンとの間の、非常に特異的かつ高感度な生物学的反応を利用しています。エンドトキシンはLAL中で凝固様カスケードを引き起こし、ゲル形成（定性検査の場合）または色の変化（定量検査の場合）をもたらします。この変化の強さはエンドトキシン濃度と相関します。

LRWがエンドトキシンフリーでない場合、試験系に外部のエンドトキシンが混入し、LAL試験を無効にしてしまう2つの重大な問題が生じる。
（１）偽陽性結果を防止する
偽陽性とは、実際にはエンドトキシンを含まない検体に対して、検査が誤ってエンドトキシンが存在すると判定する場合に発生する。
●例：LRW（低濃度水）に微量のエンドトキシンが含まれており、無菌医薬品（例えばワクチン）の希釈に使用した場合、LALテストではワクチンではなく水中のエンドトキシンが検出されます。これにより、安全な製品が誤って汚染されていると判定され、不必要な製品回収、資源の浪費、あるいは患者が重要な治療を受ける機会の遅延につながる可能性があります。
（２）正確な定量化を保証する（定量LAL試験の場合）
定量的LAL検査（例えば、動態発色法や濁度測定法）の目的は、サンプル中のエンドトキシンの正確な濃度を測定することである。
● LRW中のエンドトキシン汚染は、エンドトキシンの「未計量バックグラウンド」をもたらします。このバックグラウンドは試験サンプル中のエンドトキシンと区別できないため、サンプルの真のエンドトキシン濃度を算出することは不可能です。例えば、LRWに0.05 EU/mL（エンドトキシン単位/mL）のエンドトキシンが含まれており、試験サンプルの測定値が0.1 EU/mLだった場合、実際のサンプルエンドトキシン濃度（0.05 EU/mL）は不正確に過大評価されることになります。
（３）テストの完全性を検証する
規制機関（FDA、EMA、USP、EPなど）は、LAL試験が信頼性が高く、干渉を受けないことを保証するために、検証を実施することを義務付けています。検証の重要な要素の一つは、LRW自体がエンドトキシンを放出しないことを確認することです。
● LRWにエンドトキシンが含まれている場合、検査の「陰性対照」（LRWのみを使用）が陽性反応を示し、検査バッチ全体が即座に無効になります。つまり、そのLRWで検査されたすべてのサンプルは信頼できず、再検査が必要となり、遅延が発生します。

要約すると、LAL試薬水はLAL試験専用の高純度水です。エンドトキシンフリーという要件は必須であり、偽陽性を防ぎ、エンドトキシン定量の精度を確保し、試験の信頼性を検証します。これらはすべて、規制基準への準拠と医薬品、医療機器、その他の製品の安全性確保に不可欠です。

細菌エンドトキシン検査（BET）は主に3つの主要なアプローチに依存しており、それぞれがエンドトキシン（グラム陰性細菌由来のリポ多糖）を検出するために異なるメカニズムを利用しています。

1. ゲル凝固法（カブトガニ血球溶解液、LAL）：従来から広く用いられている方法です。カブトガニ（Limulus polyphemus）の血球溶解液を用い、エンドトキシンが溶解液中で凝固カスケードを引き起こし、エンドトキシン濃度が閾値を超えると目に見えるゲルを形成します。簡便で費用対効果が高く、定性・半定量検査に適しています。

2. 発色法（LALベース）：LALを用いるが、発色基質を組み込んでいる。エンドトキシンがLAL中の酵素を活性化し、基質を分解して着色生成物を放出する。色の強度を分光光度計で測定し、エンドトキシン濃度と相関させることで定量的な結果が得られる。

3. 濁度測定法（LALベース）：LALを用いた定量法の一つです。エンドトキシンによるLALの凝固により、溶液の濁度（濁り）が増加します。濁度は、時間経過に伴う変化（動態測定）または一定時点における変化（終点測定）によって測定され、エンドトキシン濃度を算出します。この方法は、ハイスループット検査に最適です。

より新しい、動物由来成分を使用しない代替法として、組換え型因子C（rFC）アッセイがあります。これは、LALカスケードの最初の酵素（因子C）の組換え型を使用することで、カブトガニへの依存度を低減します。エンドトキシンがrFCを活性化し、定量検出のためのシグナル（発色性または蛍光性など）を発するため、動物福祉の取り組みにも合致しています。

細菌エンドトキシン検査において、ゲル凝固法は、カブトガニ血球溶解物（LAL）とエンドトキシンとの特異的な反応に基づく定性検出法です。カブトガニの血液から抽出された凝固タンパク質成分であるLALは、試験試料中の細菌エンドトキシンと接触すると、酵素触媒による凝固反応を起こしてゲルを形成します。反応後に形成されたゲルが固く、180度反転させても流動しない場合は、試料中のエンドトキシン含有量が設定限度を超えている可能性がある（またはエンドトキシンが検出された）ことを示します。そうでない場合は、エンドトキシンは検出されません。この方法は主に、試料がエンドトキシン管理基準を満たしているかどうかを判断するために使用されます。

細菌エンドトキシン試験（BET）において、動態発色法は、単一の終点色ではなく、時間の経過に伴う発色速度を測定することによってエンドトキシンを検出・定量する定量的手法である。

この方法は、リムルスアメボサイトライセート（LAL）反応を利用しています。エンドトキシンはLAL中の酵素を活性化し、その酵素が発色基質を切断して着色生成物を放出します。発色速度（反応速度）を継続的にモニタリングし、既知のエンドトキシン濃度の標準曲線と比較することで、試験サンプル中のエンドトキシンの正確な量を算出します。この方法は高感度であり、エンドトキシンの精密な定量が必要なサンプルに広く用いられています。

細菌エンドトキシン試験（BET）において、速度論的濁度測定法は、リムルスアメボサイトライセート（LAL）試験の原理に基づいた定量的手法である。

この方法は、LAL-エンドトキシン反応混合物の濁度（濁り具合）の変化率を経時的に測定することで、細菌性エンドトキシンを検出・定量します。エンドトキシンはLAL中で凝固カスケードを引き起こし、濁度を上昇させる不溶性凝塊を形成します。この方法は、濁度上昇速度（例えば、あらかじめ設定された濁度閾値に達するまでの時間）とエンドトキシン濃度との相関関係を利用しており、エンドトキシン濃度が高いほど濁度上昇速度が速くなります。この方法により、サンプル（医薬品、医療機器など）中のエンドトキシン含有量を正確に定量することができ、連続モニタリングや広い直線性といった利点も得られます。

BETMAT rCRは、動物由来でエンドトキシンを含まない試験試薬であり、天然のLAL（リムルスアメボサイトライセート）反応を模倣することで、業界の持続可能な発展に貢献します。

リムルスアメボサイトライセート（LAL）検査の標準溶液として、最適化された動物由来成分不使用の動態発色組換えカスケード試薬（rCR）であるBETMAT rCRもご提供しています。BETMATは、天然のLAL反応を模倣するように特別に設計されており、組換え因子C、組換え因子B、および組換えプロ凝固酵素という3つの必須生物学的タンパク質を含むように、その組成と処方が綿密に設計されています。さらに、信頼性の高い性能を保証するために、主要成分が正確に調整された濃度で含まれています。

カブトガニの調達と利用に関する現在の慣行は責任ある方法で行われているものの、代替検査方法の開発に関しては、依然として大きな革新の余地がある。組換えカスケード試薬（rCR）の登場は、革新的な戦略をもたらす。バイオテクノロジーを活用することで、これらの試薬はカブトガニが本来持つエンドトキシン検出能力を再現できる。この転換は、業界全体の持続可能性目標にも合致している。

エンドトキシン試験は、医薬品、医療機器、生物製剤、または環境試料中のエンドトキシン（主にグラム陰性菌の外膜由来のリポ多糖）を検出または定量する方法です。エンドトキシンは血流に入ると、人体に発熱、ショック、臓器障害などの有害な反応を引き起こす可能性があるため、エンドトキシン試験の主な目的は、これらの製品の安全性を確保することです。一般的な試験方法としては、リムルスアメボサイトライセート（LAL）試験と組換え因子C（rFC）試験があります。

検査室におけるエンドトキシン検査は、主に2つの主要な方法に依存しています。リムルスアメボサイトライセート（LAL）試験（従来から広く用いられている方法）と、組換え型因子C（rFC）試験（動物由来成分を使用しない代替法）です。以下に、これらの方法の典型的なワークフローを示します。
1. 試験前の準備
試料の取り扱い：試験試料（医薬品、医療機器洗浄液、生物学的製剤など）をエンドトキシンフリー水で希釈し（干渉を避けるため）、pHを6.0～8.0（試薬反応に最適）に調整して準備します。
試薬および材料の準備：すべての器具（ピペットチップ、試験管、容器）がエンドトキシンフリーであることを確認してください（脱パイロジェン処理、例えば250℃で30分以上乾熱滅菌）。LAL試薬（2～8℃で保存）を解凍するか、rFC試薬を指示に従って再構成してください。
陽性/陰性対照：陽性対照として標準エンドトキシン溶液（例：大腸菌O113:H10エンドトキシン）を、陰性対照としてエンドトキシンを含まない水を準備します（試薬の有効性を確認するため）。

2. コアテスト手順（方法別）
方法1：リムルスアメボサイトライセート（LAL）試験
LALはカブトガニの血液細胞から抽出したタンパク質で、エンドトキシンに曝露されると凝固反応または発色反応を起こします。一般的な形態は3種類あります。
ゲル凝固法（定性的／半定量的）：
1. 試験管内で、LAL試薬とサンプルを等量（例えば、それぞれ0.1 mL）混合します。
2. 37±1℃で60±2分間インキュベートする（振盪しない）。
3. 試験管を逆さまにする：固形ゲルが形成され（流動しない場合）、サンプルはエンドトキシン陽性である。ゲルが崩壊する場合は陰性である。半定量分析の場合は、サンプルを段階希釈してエンドトキシン濃度を推定する。

濁度測定法（定量法）：
1. マイクロプレート/キュベット内で、LAL試薬とサンプル（または標準エンドトキシン）を混合します。
2. 37±1℃で培養し、分光光度計を用いて時間の経過に伴う濁度の変化（LALの凝固により濁度が増加する）をモニタリングする。
3. サンプルの濁度曲線と標準曲線を比較して、正確なエンドトキシン濃度を算出する。

発色法（定量法）：
1. LAL試薬（発色基質を含む）と試料を混合します。エンドトキシンがLAL酵素を活性化し、基質を切断して着色生成物を放出します。
2. 培養後、特定の波長（例：405 nm）で着色溶液の吸光度を測定する。
3. 標準曲線（既知のエンドトキシン濃度を用いて作成）を使用して、サンプルのエンドトキシンレベルを定量します。

方法2：組換え型因子C（rFC）検査
rFCは遺伝子操作されたタンパク質（LALのエンドトキシン反応の最初のステップを模倣したもの）であり、カブトガニへの依存を回避します。そのワークフローは発色性LAL法と類似しています。
1. rFC試薬（発色基質を含む）とサンプルを混合します。
2. 37±1℃でインキュベートする。エンドトキシンがrFCに結合し、酵素を活性化して基質を切断し、発色する。
3. 吸光度を測定し、標準曲線を用いてエンドトキシン濃度を算出する。

3. 結果の検証
陽性対照では期待される反応（ゲル形成、色の変化など）が見られ、陰性対照では反応が見られないことを確認する（汚染の可能性を排除するため）。
- サンプルに妨害物質（洗剤、タンパク質など）が含まれている場合は、検証テスト（スパイク回収率：サンプルに既知量のエンドトキシンを添加し、回収率が50%～200%であるかどうかを確認する）を実施します。
- 製品がエンドトキシン制限値（例：注射剤の場合は0.25 EU/mL未満）を満たしているかどうかを判断するために、有効な結果のみが使用されます。

細菌エンドトキシンは、グラム陰性菌の外膜に含まれるリポ多糖（LPS）成分です。細菌が死滅または溶解する際に放出され、宿主において免疫反応（発熱、炎症など）を引き起こし、高濃度では敗血症性ショックなどの重篤な反応を引き起こすこともあります。

エンドトキシン検査は、主に以下の種類の製品に対して必要とされます。これらの製品は、エンドトキシン（グラム陰性菌由来）に汚染されている場合、人体（特に血流や無菌組織）との接触によってリスクが生じるためです。

● 医薬品：非経口投与薬（例：注射剤、点滴剤、ワクチン）、眼科用製剤、および一部の点鼻スプレー（滅菌済みまたは半滅菌済み）。

● 医療機器：血液に接触する機器（例：カテーテル、透析装置）、無菌組織に挿入される機器（例：外科用インプラント）、または眼科／神経外科手術で使用される機器。

● 生物製剤：生物製剤（例：モノクローナル抗体、組換えタンパク質）、細胞・遺伝子治療、および生物学的抽出物（例：血漿由来製剤）。

● 医薬品添加物および製造材料：上記製品の製造に使用される原材料（例：注射用水、緩衝剤、充填剤）で、製造中にエンドトキシンが混入するのを防ぐためのもの。

発熱物質試験 vs. 細菌エンドトキシン試験

発熱物質試験は、生きた動物（例えばウサギ）の体温変化をモニタリングすることで、医薬品や医療機器に含まれる発熱誘発物質（発熱物質）をすべて検出する。この試験は広範囲に及ぶが時間がかかり、動物福祉上の懸念も生じる。

細菌エンドトキシン試験（BET）、例えばリムルスアメボサイトライセート（LAL）アッセイは、グラム陰性菌由来の主要な発熱物質であるエンドトキシンを特異的に標的とする。BETは迅速で高感度、費用対効果が高く、動物実験も不要であるが、エンドトキシンのみを検出し、他の発熱物質は検出できない。現在ではほとんどの場合BETが好まれ、BETが不適切な場合には発熱物質試験が用いられる。

細菌エンドトキシン試験（BET）は、試験サンプル中のエンドトキシン（主にグラム陰性菌由来）を検出または定量することを目的としています。従来の試験管には、製造工程や保管中の汚染などにより、本来的にエンドトキシンが含まれている可能性があるため、エンドトキシンフリーの試験管が必要です。これらの外因性エンドトキシンは試験を妨害し、結果を誤って高くしてしまうため、サンプル自体に有害なエンドトキシンが含まれているかどうかを誤って判断してしまう可能性があります。エンドトキシンフリーの試験管を使用することで、この妨害が排除され、試験の正確性と信頼性が確保されます。

エンドトキシン検出において、試験システム（例えば、サンプル、試薬、希釈液）が通常の試験管からのエンドトキシンによって汚染されるリスクがある場合、偽陽性結果が生じたり、検出の精度が損なわれたりする可能性があるため、エンドトキシンフリーの試験管を選択することが必要となる。

これは特に次のような状況において重要です。

● 極めて低いエンドトキシン濃度のサンプル（例：医薬品グレードの注射用水、滅菌注射薬）の検出。

● 高感度検出法（例：動的濁度測定法または発色性リムルスアメボサイトライセート（LAL）アッセイ）を使用する。

●試薬希釈液、サンプル希釈液、または陰性対照液の調製。エンドトキシンフリーでないチューブからの微量のエンドトキシンでも検査が無効になる可能性がある。

両者は同じではない。「発熱物質」の範囲に基づく重要な違いがある。

● 発熱物質とは、発熱を引き起こすすべての物質（内因性または外因性）を指し、内毒素（グラム陰性細菌由来のリポ多糖の一種）が最も一般的な外因性発熱物質である。

● 発熱物質フリー試験管：あらゆる種類の発熱物質（エンドトキシンやその他の発熱を引き起こす物質を含む）を除去します。

● エンドトキシンフリー試験管：エンドトキシンのみを標的として除去します（必ずしも他の非エンドトキシン性発熱物質を除去するわけではありません）。

つまり、エンドトキシンフリーは発熱物質フリーのサブセットであるが、発熱物質フリーの方がより広い精製範囲を持つ。